Введение  Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро-, так и микронутриентами, в том числе и эссенциальными микроэлементами, в частности железом. Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной и во многих от­ношениях нерешенной проблемой современной ме­дицины. Недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них яв­ляется развитие железодефицитной анемии [1].Учитывая, что в повседневной жизни человек по­требляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способст­вует лучшему усвоению организмом этого микро­элемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа. По нашему мнению, наиболее удобным объ­ектом для биотехнологического получения железа в органической форме являются пропионовокислые бактерии, которые обладают способностью синтези­ровать значительное количество гемсодержащих ферментов и корриноидов, повышающих усвоение железа [2].Известно, что железо в организме может всасы­ваться только в виде Fe2+. Однако двухвалентное же­лезо подвергается быстрому химическому окисле­нию, переходя в нерастворимую, неусвояемую орга­низмом трехвалентную форму. Для сохранения био­доступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способст­вуют солюбилизации минералов, сохраняя их в рас­творимом состоянии. Одним из представителей та­кого рода хелаторов являются казеиновые фосфо­пептиды (СРРs). СРРs – это фосфолированные пеп­тиды, образующиеся из казеинов коровьего молока при их переваривании пищеварительными протеина­зами [3]. Следует отметить, что до сих пор казеино­вые фосфопептиды недостаточно изучены и как хе­латирующие «агенты» для минералов, и как потен­циальные нутрицевтики в питании человека. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о влиянии СРРs на солюбилизацию железа. Поэтому исследо­вание железосвязывающей способности СРРs пред­ставляет большой интерес.Цель работы – выяснение влияния различных концентраций сульфата железа на рост и биосинтез внеклеточных метаболитов пропионовокислыми бактериями, а также исследование хелатирующих свойств казеиновых фосфопептидов.  Материалы и методы Бактерии и условия культивирования. Объектом исследования служили культуры пропионовокислых бактерий (ПКБ): штаммы Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС-2503, Propioni-bacterium freudenreichii subsp. freudenreichii АС-2500, Propionibacterium cyclohexanicum Kusano АС-2260 и Propionibacterium cyclohexanicum Kusano АС-2259, полученные из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и фи­зиологии микроорганизмов (Москва), активизиро­ванные уникальным биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государст­венном технологическом университете. В качестве источника железа использовали двухвалентную соль (FeSO4). Культивирование пропионовокислых бакте­рий осуществляли на сывороточной среде с добавле­нием ростовых факторов [4]. В качестве инокулята использовали суточную культуру, выращенную на обезжиренном молоке. Сульфат железа добавляли в ростовую среду в концентрации 0,25–0,55 мг/мл. Культивирование пропионовокислых бактерий в присутствии сульфата железа осуществляли в тече­ние 24 часов при температуре 30 оС. Кинетику роста культур рассчитывали общепринятыми методами.Аналитические методы. За процессом связыва­ния железа следили по количеству образованного хе­латированного Fe2+ (% железа, оставшегося в двух­валентной форме от первоначальной дозы). Количе­ство железа (Fe2+) определяли референтным методом [5]. Количество железа (Fe3+) определяли спектрофо­тометрическим методом. Методика разработана в соответствии с ОСТ 34-70-953.4-88. Сущность ме­тода основана на взаимодействии растворенного же­леза с сульфосалициловой кислотой и измерении оп­тической плотности образующихся при этом окра­шенных растворов.Определение внеклеточных метаболитов прово­дили в конце фазы экспоненциального роста. Актив­ность каталазы определяли колориметрическим ме­тодом [6], активность пероксидазы – спектрофото­метрически с о-дианизидиновым реактивом [7], ак­тивность супероксиддисмутазы – по аутоокислению адреналина [8].Антимутагенную активность определяли по тесту Эймса [2], адгезивные свойства изучали на формали­низированных эритроцитах по развернутому методу В.И. Брилис, об адгезивности штамма судили по ин­дексу адгезивности микроорганизма (ИАМ) [9], кон­центрацию экзополисахаридов – антроновым мето­дом [10], содержание витамина В12 – спектрофото­метрическим методом [11]. Раствор казеиновых фосфопептидов получали пу­тем ферментативного гидролиза натриевого казеи­ната. Известно, что металлосвязывающая способ­ность СРРs зависит от степени фосфорилирования. С целью получения гидролизата с максимальным со­держанием низкомолекулярных фосфолированных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать растворимые комплексы с железом, нами были уточнены технологические па­раметры выделения СРРs. При получении СРРs при­меняли схему одностадийного гидролиза казеината Na с использованием пепсина и трипсина при разной продолжительности гидролиза. Молекулярно-массо­вое распределение пептидов в составе водного рас­твора казеиновых фосфопептидов оценивали экс­клюзионной хроматографией среднего давления на колонке TSK GEL (0,8/30 см). Содержание хелатиро­ванного железа определяли методом масс-спектро­метрии. В таблицах обсуждаются статистически дос­товерные различия при р < 0,05. Результаты и их обсуждениеИзучение адгезивных свойств пропионовокислых бактерий. Одним из актуальных направлений совре­менной микробиологии является изучение адгезив­ного процесса различных микроорганизмов. Адгезия – это межклеточное взаимодействие, выражающееся в прочном прикреплении клеток к субстрату. Что ка­сается пропионовокислых бактерий (ПКБ), инфор­мация об их адгезивных свойствах в литературе нами не обнаружена.Следует отметить, что от адгезивных свойств во многом зависит состав, стабильность и защитные свойства микрофлоры макроорганизма. В связи с этим дальнейшие исследования направлены на изу­чение адгезивных свойств разных штаммов пропио­новокислых бактерий. В качестве клеток макроорга­низма были выбраны клетки формалинизированных эритроцитов. Адгезивный процесс ПКБ с эритроци­тами представлен на рис. 1.    а   б   в               г Рис. 1. Взаимодействие ПКБ с эритроцитами: а – P. freи-denreichii subsp. hermanii АС-2503; б – P. cyclohexanicum Kusano АС-2259; в – P. freudenreichii subsp. freиdenreichii АС-2500; г – P. cyclohexanicum Kusano АС-2260Анализ данных, представленных на рис. 1, пока­зывает, что пропионовокислые бактерии обладают различной способностью адгезироваться на эритро­цитах. Выявлено, что некоторые штаммы адгезиру­ются в виде отдельных бактериальных клеток       (рис. 1, б, в, г), а также агрегатов, которые почти полностью закрывают эритроциты (рис. 1, а). Адгезивные свойства культур оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ); об адгезивности штамма судили по индексу адгезивности микроорга­низма (ИАМ). Согласно методике микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ менее 1,75; низко­адгезивными − от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными – от 2,51 до 4,0; высокоадгезивными – при ИАМ более 4,0. Результаты исследований представлены в табл. 1.                    Таблица 1 Адгезивность пропионовокислых бактерий ШтаммСПАКУЭ,%ИАМ (М±m)Адге­зивностьP. freudenreichii subsp. freuden-reichii АС-25003,2794,0±1,5Средне-адгезив-ныйP. cyclohexanicumKusano АС-22603,9823,7±1,2Средне-адгезив-ныйP. freudenreichii subsp. shermanii AC-25034,6855,4±1,1Высоко-адгезив-ныйP. cyclohexanicumKusano АС-22593,3803,1±1,8Средне-адгезив-ный Из данных табл. 1 следует, что пропионовокис­лые бактерии обладают достаточно высокими адге­зивными свойствами. Установлено, что из всех изу­ченных культур высокоадгезивным штаммом явля­ется Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС-2503, о чем свидетельствует индекс адгезивности (ИАМ = 5,4), а также показатели СПА (4,6) и КУЭ (85 %). Следовательно, этот штамм лучше других за­крепится на клетках кишечника, создавая защитный барьер. Остальные штаммы по всем исследуемым показателям проявили среднюю степень адгезивно­сти.Изучение влияния сульфата железа на рост и биосинтез внеклеточных факторов адаптации про­пионовокислых бактерий. Внеклеточные метабо­литы, синтезируемые микроорганизмами и регули­рующие их активность, называются ауторегулято­рами. Важно подчеркнуть, что среди многочислен­ных функций ауторегуляторов крайне слабо изучены факторы, обеспечивающие адаптацию микроорга­низмов к неблагоприятным физико-химическим ус­ловиям среды.В связи с этим в дальнейших исследованиях изу­чали влияние сульфата железа на синтез экзометабо­литов пропионовокислыми бактериями. Известно, что биологический эффект взаимодействия микроор­ганизмов с металлами определяется концентрацией металла, степенью его токсичности и метаболиче­ским потенциалом микроорганизмов [12]. Результаты наших исследований (рис. 2) пока­зали, что сульфат железа до определенной концен­трации (0,25 мг/мл для P. freudenreichii subsp. freudenreichii АС-2500 и 0,35 мг/мл для всех осталь­ных штаммов) повышает удельную скорость роста пропионовокислых бактерий, что свидетельствует о необходимости железа для нормального метаболизма клетки. Дальнейшее увеличение концентрации в среде FeSO4 приводит к замедлению скорости роста. При этом количество жизнеспособных клеток остается на высоком уровне (1011 КОЕ/см3). Следует отметить, что избыточное содержание металла ингибирует метаболизм, в этом случае включаются защитные механизмы, компенсирующие отрицательное действие металла.   Рис. 2. Влияние сульфата железа на скорость роста пропионовокислых бактерий При исследовании биотехнологического потен­циала нами было установлено, что пропионовокис­лые бактерии синтезируют значительное количество гемсодержащих ферментов [13]. Поскольку синтез и активность гемовых ферментов зависят от содержа­ния в среде ионов железа, дальнейшие исследования направлены на изучение влияния FeSO4 на биосинтез каталазы, пероксидазы и СОД. Результаты исследо­ваний приведены в табл. 2. Таблица 2 Влияние сульфата железана активность антиокислитель­ных ферментов, синтезируемых пропионовокислыми бактериями ШтаммСодержа­ние же­леза, мг/млАктивность ферментовКаталаза, мкат/млПероксидаза,нмоль/(мин·мг белка)СОД,ед/мг белкаP. freuden-reichii subsp.freuden-reichii АС-250001280,01,5731,020,251290,51,5721,770,351300,91,5721,770,451492,51,5701,780,551490,61,5711,78Окончание табл. 2 ШтаммСодержа­ние же­леза, мг/млАктивность ферментовКаталаза, мкат/млПероксидаза,нмоль/(мин·мг белка)СОД,ед/мг белкаP. cyclohe-xanicum Kusano АС-226001712,20,9051,030,251802,50,8901,850,351895,30,8531,860,451907,40,8501,860,551912,30,8531,86P. cyclohe-xanicum Kusano АС-225901561,91,1181,010,251807,01,1251,830,351991,11,1221,830,452007,01,1191,830,552091,31,1191,84P. freuden-reichii subsp. shermanii АС-250302318,61,1131,170,252554,81,1121,980,352789,31,1131,990,452954,31,1122,010,552952,31,1132,01 Анализ данных табл. 2 показал, что с увеличением дозы железа у всех изученных штаммов происходит увеличение активности таких ферментов, как ката­лаза и СОД. Увеличение концентрации сульфата же­леза в среде до 0,45–0,55 мг/мл приводит к возраста­нию активности каталазы (в среднем) в 1,5 раза, а СОД – в 1,7–1,85 раза. Что касается пероксидазы, то ее активность во всех опытных образцах практиче­ски не изменялась. Вероятно, это объясняется накоп­лением только эндофермента. Установлена корреля­ционная зависимость между активностью ферментов (Y) и концентрацией сульфата железа:  Y1 = –38,90х2 + 40,61х + 19,40 – по СОД;Y2 = –0,115х2 + 0,861х + 0,514 – по каталазе. Коэффициенты корреляции R1,2 составляют 0,990 и 0,898 соответственно.Следует отметить, что увеличение активности ка­талазы и СОД значительно повышает способность пропионовокислых бактерий защищаться от окисли­тельного стресса, поскольку именно эти ферменты способны выводить из клеток супероксидные ради­калы.Из литературных данных известно, что защита от токсичной концентрации металла у микроорганиз­мов проявляется в образовании различных веществ, связывающих металл в форме малотоксичных со­единений. В связи с этим дальнейшие исследования были посвящены изучению влияния сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации бакте­рий. Результаты исследований представлены в табл. 3.Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что добавление ионов железа в питательную среду для культивирования ПКБ стимулирует синтез вне­клеточных метаболитов. Так, было отмечено, что с увеличением дозы FeSO4 наблюдается более высокая антимутагенная активность пропионовых бактерий, что указывает на индукцию антимутагенеза. Повы­шенный биосинтез экзополисахаридов (ЭПС) при добавлении железа – это проявление нефермента­тивной защиты бактерий, когда ЭПС препятствуют проникновению излишнего железа в клетку за счет ее обволакивания. Увеличение адгезии объясняется не только защитной реакцией культур по отношению к металлу, но и тем, что согласно литературным данным наличие в среде двух- и трехвалентных ка­тионов приводит к уменьшению толщины двойных заряженных слоев на поверхностях в водных средах, что способствует адгезии за счет уменьшения элек­тростатических сил отталкивания. Таблица 3 Влияние сульфата железа на синтез внеклеточных метаболитов ШтаммСодер­жаниежелеза, мг/млПоказательАдге­зивная актив­ность (ИАМ) ЭПС, мкг/млИнгиби­рование (антиму­тагенная актив­ность), %Коли­чество вита­мина В12, мкг/млP. freuden-rеichii subsp. freиdenreichii АС-250004,029,8143,631,00,254,029,9644,232,00,354,230,0544,832,50,454,635,5048,934,00,555,136,8048,634,5P. cyclohe-xancum Kusano   АС-226003,731,8546,222,00,253,832,5648,926,00,353,936,9848,727,00,454,437,2048,629,00,554,748,3057,928,0P. cyclohe-xancum Kusano   АС-225902,836,6544,818,00,253,136,9046,218,00,353,636,9947,518,00,454,238,7052,819,00,554,644,7854,219,5P. freиden-reichii subsp.shermanii АС-250305,441,3047,733,00,255,444,5249,635,00,355,849,5650,135,50,456,150,2051,236,00,556,356,5857,336,0 При исследовании морфологии пропионовокис­лых бактерий, культивируемых при разных концен­трациях железа, было отмечено, что с увеличением дозы FeSO4 до 0,55 мг/мл наблюдалось скопление клеток (когезия). Вероятно, в условиях межклеточ­ных контактов посредством агрегации клетки под­держивают свою жизнеспособность.Полученные результаты свидетельствуют о том, что синтез экзометаболитов способствует адаптации пропионовокислых бактерий к ионам железа. Выяв­ленные закономерности не только позволяют понять принцип метаболической организации у пропионо­вокислых бактерий, но и служат научной основой для создания биологически активных добавок, со­держащих железо в органической биодоступной форме. Влияние казеиновых фосфопептидов на солюби­лизацию железа в питательной среде. При проведе­нии экспериментальных исследований нами было отмечено, что при содержании железа в среде 0,45 мг/мл и более изменяется окраска концентратов и выпадает осадок, что свидетельствует об образова­нии нерастворимых Fe3+ ионов. В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали влияние казеи­новых фосфопептидов (СРРs) на солюбилизацию (хелатирование) железа в питательной среде. Известно, что металлосвязывающая способность СРРs зависит от степени фосфорилирования. С це­лью получения гидролизата с максимальным содер­жанием низкомолекулярных фосфорилированных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать растворимые комплексы с железом, нами были уточнены технологические па­раметры выделения СРРs. При получении СРРs при­меняли схему одностадийного гидролиза казеината Na с использованием протеолитических ферментов. Результаты исследований представлены в табл. 4.  Таблица 4 Молекулярно-массовое распределение фракций в составе ферментолизатов Пределы молеку­лярных масс, кДРазмеры пептидных фракций в гидролизатах, нмФерментыпеп-синтрип-синхимо-зин> 20> 1010,5–20,520,1–18,77–109,2–22,618,7–12,55–77,65,718,412,5–11,04–515,715,416,711,0–5,13–419,513,211,85,1–2,8~ 314,417,09,42,8–1,01–211,726,6–< 1< 110,122,1–  а  б Рис. 3. Масс-спектры гидролизатов до и после внесения железа: а – гидролизат без железа; б – гидролизат с добавлением железа     а   б   в Рис. 4. Содержание железа в хроматографиче­ских фракциях комплекса железа с трипсиновым (а), пепсиновым (б) и химотрипсиновым (в) гидролизатом казеината натрия     Таблица 5 Влияние дозы сульфата железа и протеолитических фер­ментов на содержание хелатированного железа Доза вносимого сульфата железа, мг/млСодержание хелатированного железав водных растворах казеиновыхфосфопептидов, мггид­ролиз пеп­синомгидролиз трипси­номгидролиз химозиномгидро­лиз хи­мотрип­сином10,510,870,480,7120,881,990,981,1231,472,671,252,5241,993,131,873,2552,104,982,124,1862,895,252,585,1672,996,962,986,4583,587,273,157,1594,128,124,128,45104,697,725,126,89 Данные, представленные в табл. 4 и 5 и на рис. 3 и 4, свидетельствуют о том, что казеиновые фосфопеп­тиды образуют с ионами железа хелатные ком­плексы, представляющие собой наноразмерные час­тицы. Такие частицы будут эффективно связываться с клеточной поверхностью, легко переносить ионы железа через кишечную стенку и защищать минерал от взаимодействия с другими элементами в желудке.В результате проведенных исследований моди­фицирована технологическая схема получения ка­зеиновых фосфопептидов (рис. 5). Натрия казеинат¯Эндопротеиназа (переваривание)¯Гидролиз (подкисление рН 4,6)¯Удаление непептидного материала (центрифугирование)¯Осаждение 15 % ТХУ кислотой¯Центрифугирование ¯ Введение FeSO4 ®   Раствор, обогащенный ССРs¯Нанофильтрация¯Раствор ССРs с хелатированным железом  Рис. 5. Модифицированная технологическая схема по­лучения казеиновых фосфопептидов Существует мнение, что искусственные хелатные формы минералов при хранении разрушаются и те­ряют свою эффективность, поэтому они уступают природным органическим солям этих элементов. В связи с этим исследовали сохранность железа, хела­тированного казеиновыми фосфопептидами, в двух­валентной форме в процессе длительного хранения. Результаты исследований представлены в табл. 6.Таблица 6 Влияние СРРs на процесс солюбилизации железа при хранении ШтаммСодер­жание СРРs, %Содержание Fe2+ в среде при хранении (% от первоначаль­ной дозы внесения), сут.306090120P. freudenreichii subsp. freuden-reichii АС-2500контроль19,019,019,518,51058,062,062,560,02088,088,088,588,0P. cyclohexa-nicum Kusano АС-2260контроль30,029,530,028,51069,070,570,069,02094,595,095,094,5P. cyclohexa-nicum Kusano АС-2259контроль32,032,030,529,01060,060,560,059,52075,075,075,575,0P. freudenreichii subsp. shermaniiАС-2503контроль22,025,025,519,01066,067,066,063,52095,096,096,095,0 Данные, приведенные в табл. 6, указывают на то, что в процессе хранения количество хелатирован­ного железа в концентратах, содержащих раствор СРРs, практически не изменилось, тогда как в кон­троле наблюдалось значительное снижение содержа­ния растворимых ионов Fe2+.Совокупность полученных данных указывает на то, что казеиновые фосфопептиды являются пер­спективными хелатирующими агентами для получе­ния новых, биодоступных форм железа. В результате исследований подобраны оптимальные дозы FeSO4 и водного раствора СРРs, обеспечивающие макси­мальное количество солюбилизированного железа. Выводы1. Установлено, что активизированные культуры пропионовокислых бактерий синтезируют гемсо­держащие ферменты (каталазу, СОД, пероксидазу), что открывает широкие перспективы для их практи­ческого применения.2. Подобраны оптимальные дозы сульфата же­леза, обеспечивающие активный рост и высокое ко­личество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий. 3. Отмечено, что добавление ионов железа в пи­тательную среду стимулирует синтез внеклеточных метаболитов, которые способствуют адаптации про­пионовокислых бактерий к металлу.4. Исследовано молекулярно-массовое распреде­ление и последовательность пептидных фракций в составе казеиновых фосфопептидов на наноуровнях.5. Модифицирован способ выделения казеиновых фосфопептидов, обеспечивающий максимальный выход низкомолекулярных пептидных наноструктур с характерными размерами 1–10 нм, способных хелатировать максимальное количество железа (до 7 мг/мл железа).6. Изучены комплексы казеиновых фосфопепти­дов с микроэлементами, охарактеризован механизм связывания ионов минерала с пептидными фрак­циями в составе комплексов и определено точное со­держание хелатированного минерала.