ВведениеОдним из видов растительного сырья,содержащего широкий комплекс биологическиактивных соединений, является бесплодная формафитопатогенного гриба Трутовика скошенного– Inonotus obliquus (Pers.) Pil. formasterilis (Van.)Nikol., сем. Гименохетовых – Hymenochaetaceae,тип Базидиальные грибы (Basydiomycetes). Грибразвивается в виде бесформенных наростовна березах и известен под названием «чага»или «березовый гриб» [1]. Извлечения грибаобладают антираковыми, противоопухолевыми,противовирусными и антиоксидантными свойства-ми [2, 3].В технологии получения препаратов на основегриба Inonotus obliquus основным процессом являетсяэкстрагирование сырья с помощью воды или другогоорганического растворителя, разрешенного дляиспользования в фармацевтической и пищевойпромышленности. Полифенолоксикарбоновыйкомплекс, образующий в водных извлеченияхколлоидную гидрофильную полидисперснуюсистему, составляет основную часть веществ,экстрагируемых водой из чаги. Большинствоспособов экстракции заключается в полученииводных излечений. Дисперсионная среда этойсистемы содержит соли органических и минеральныхкислот, полисахариды, полифенолы и другие, еще невыявленные, компоненты [4].Несмотря на многочисленные существующиеспособы экстракции гриба Inonotus obliquus,основанные на использовании разных растворителей,отсутствуют сведения об использовании сверхкри-тического диоксида углерода в технологииполучения экстрактов березового гриба.Экстракционная способность диоксида углерода вдо- и сверхкритическом состоянии представленав работах отечественных и зарубежныхавторов [5–10]. Показано, что сверхкритическаяэкстракция, по сравнению с докритической, обладаетвысокой экстрагирующей способностью и извлекаетширокий спектр соединений, включая органическиекислоты, фенольные соединения, гликозиды,флавоновые агликоны, токоферолы и терпеноиды.Структурно-групповой состав экстрактовгриба Inonotus obliquus составляют углеводороды,полифенолы, стерины, стеролы, тритерпеныланостанового типа, тритерпеновые спирты и эфиры.© N.G. Li, T.K. Kalenik, 2021Abstract.Introduction. Plant materials are susceptible to microbial contamination at all stages of the technological process and storage. Thisproblem becomes highly relevant when extracting biologically active compounds from the Inonotus obliquus chaga mushroom. Ifused in food systems, contaminated extracts may cause their subsequent microbial contamination, as well as deterioration of qualityand safety, which inevitably leads to economic losses and health risks. Inonotus obliquus is a popular component of various functionalfoods; therefore, the microbiological purity of its extracts requires a thorough analysis. In this regard, toxicity in a living test object isanother important aspect of the safety studies of extracts and biologically active compounds. Before introducing a new food additiveor component into the food system, it has to be tested for toxic properties.Study objects and methods. The research featured aqueous and supercritical CO2-extracts of the Inonotus obliguus chaga mushroom.The aqueous extract was obtained according to the method specified in the State Pharmacopoeia of the USSR. The supercriticalCO2 extraction was obtained using a Thar SFE-500F-2-FMC50 supercritical fluid extraction system. Microbiological indicators weredetermined by standard operating methods. The relative biological value and possible toxic properties were measured by biotesting onTetrahymena pyriformis.Results and its discussion. During the entire tested storage period, the microbial contamination of the extracts remained at a lowlevel, while the contaminants in the supercritical extract showed signs of microbial deactivation by carbon dioxide. The experimenton the ciliates demonstrated no inhibition of motility and growth, the shape of the cells was oval, even, and the cell walls remainedunaffected, which means that the extracts produced no toxic effect.Conclusion. The extracts of the Inonotus obliguus mushroom proved to be biologically valuable and toxicologically safe. The test onTetrahymena pyriformis showed stable and traceable microbiological indicators. Therefore, aqueous and supercritical CO2 extracts ofInonotus obliguus can be used in food industry.Keywords. Chaga, mushroom, herbal extracts, toxicity, microbial inactivation, contamination, Tetrahymena pyriformis, relativebiological valueFunding. The research was carried out on the premises of the Department of Food Science and Technology of School of Biomedicineof Far Eastern Federal University (FEFU) .For citation: Li NG, Kalenik TK. Safety Assessment of Aqueous and Supercritical CO2 Extracts of the Chaga Mushroom Inonotusobliguus. Food Processing: Techniques and Technology. 2021;51(1):125–133. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2021-1-125-133.127Ли Н. Г. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 1 С. 125–133Особенностью сверхкритического СО2-экстрактаInonotus obliquus является содержание большогочисла полифенольных соединений, которые обладаютантиоксидантным действием [2, 5].Однако в вопросах экстракции биологическиактивных соединений из гриба Inonotus obliquusследует обратить внимание на проблемуподверженности сырья микробной контаминациина всех этапах технологического процесса (сбор,первичная обработка, сушка, измельчение, упаковка)и хранения. К факторам, повышающим микробноеобсеменение и приводящим к порче сырья, относят:влажность, температуру, запыленность, присутствиенасекомых и др. Внешними проявлениями микробнойпорчи растительного сырья являются изменениецвета и консистенции, загнивание, плесневение. Приэтом происходит разрушение ценных биологическиактивных соединений, а использование такого сырьястановится бесполезным и небезопасным.Особую опасность представляют собой плесневыегрибы, которые на протяжении многих летявляются частыми контаминантами растительноголекарственного сырья. Среди плесневых грибов-контаминантов более 60 % относятся к родамAspergillus и Penicillium, многие из которых известныкак потенциальные продуценты микотоксинов [11].В пищевой и фармацевтической промышленностипервостепенным является входной контрольисходного сырья и материалов, регулированиеусловий хранения и переработки. Использование вкачестве компонентов пищевых систем экстрактов иизвлечений, контаминированных микроорганизмами,несет угрозу последующей микробной загрязнен-ности пищевого продукта и ухудшению егопоказателей качества и безопасности. Это неизбежноприводит к экономическим потерям и риску дляздоровья потребителя. В этой связи необходимымпредставляет исследование микробиологическойчистоты полученных экстрактов, в том числеэкстрактов гриба Inonotus obliquus, предлагаемых длявнесения в пищевые продукты.Вторым немаловажным аспектом исследованиябезопасности экстрактов и биологически активныхсоединений является изучение токсичности наживом тест-объекте. Перед использованием любойразработанной пищевой добавки или компонента,вводимого в состав пищевой системы, необходимопровести исследование на предмет отсутствиятоксических свойств. Токсичность испытуемойдобавки или пищевого продукта предлагаетсяопределять методом биотестирования по количествуинфузорий Tetrahymena pyriformis, выжившихили погибших в среде [12]. Выбор данного тест-организма обусловлен быстротой проведенияанализа, его относительной простотой и дешевизной,высокой чувствительностью к алиментарным итоксическим факторам и наглядностью проявлениябиологически активного эффекта. Физиологическиеизменения, поведенческая активность и реакцииклеточных органелл этого организма являютсяпоказательными индикаторами присутствияразличных токсикантов [13, 14]. При определениитоксичности разработанных продуктов основнымипоказателями являются поведение и характер ростаклеток. Угнетение подвижности, замедление роста,незначительные деформации инфузорий, а также ихгибель свидетельствуют о токсичности исследуемогопродукта или добавки.Целью работы является оценка пищевойбезопасности водного и сверхкритическогоэкстрактов гриба Inonotus obliguus.Объекты и методы исследованияВодный экстракт гриба Inonotus obliguusполучали по методу, указанному в ГосударственнойФармакопее СССР [15].Сверхкритическую СО2-экстракцию проводилипри использовании сверхкритической системыфлюидной экстракции Thar SFE-500F-2-FMC50(Parr Instrument, США). Углекислый газ сжат дожелаемого давления при помощи компрессорааппарата сверхкритической экстракции. Емкостьэкстрагирования нагрета с помощью горячегокожуха, температура контролировалась термостатом(± 1 °С). Давление контролировалось дозирующимклапаном. Обедненный шрот гриба Inonotusobliquus массой 50 г загружался в однолитровыйэкстрактор и экстрагирован sc-СО2 в скоростипотока жидкости 250 г/мин. Доля модификатора (со-растворителя) EtOH составила 4,5 %. Для получениясверхкритического СО2-экстракта были заданыследующие экстракционные условия: давлениесверхкритического диоксида углерода в диапазоне30–60 МПа; температурные режимы 40–70 °С; времявоздействия 2 ч. Экстракт был собран в сепараторе,сообщающемся с дозирующим клапаном.Общее микробное число (ОМЧ) экстрактовопределяли по ГОСТ 10444.15-94. Количестводрожжей и плесневых грибов в экстрактахопределяли по ГОСТ 10444.12-2013.Для проведения анализа на токсичность пометодике, указанной в пособии авторов [12], готовилиряд пробирок (в 3-х параллелях), содержащих2 мл углеводно-солевой дрожжевой среды (УСД),в которые внесли по 1 мл сверхкритическогоСО2-экстракта или 0,5 % к массе среды УСДсухого экстракта. Контролем в этом экспериментеслужат 3 параллельных пробирки с 2 мл УСД,в которые добавляется 1 мл физиологическогораствора. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл3–6 суточной культуры инфузорий Tetrahymenapyriformis и оставляют при температуре от 20 до128Li N.G. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 1, pp. 125–13325 °С в защищенном от прямых солнечных лучейместе. Через 0,25–24 ч учитывают эффект биопробыв капле, взятой стерильной пастеровской пипеткой,на предметном стекле под микроскопом путемпросмотра всего объема капли и всех ее слоев.Для определения относительной биологическойценности (ОБЦ) по методике, указанной в [12],перед анализом в исследуемых пробах определяютсодержание белка (%) любым доступным методом.Для сопоставимости результатов расчет навескигомогенизированной пробы при внесении в средуосуществляется таким образом, чтобы в 1 млсодержалось 0,3 мг азота.Навеску гомогенизированной пробы исследуемогообразца в количестве 0,6 мг по азоту помещают вступку или гомогенизатор, добавляют 2 мл УСД,растирают и перемешивают пестиком в течение1–2 мин.Для повышения достоверности результатови минимизации потерь образца массу навески иколичество среды следует увеличить в 5–50 раз.Каждый образец готовят в 3–5 повторностях.В каждую пробирку вносят по 2 мл полученнойсуспензии продукта, содержащей 0,6 мг азота, изакрывают резиновыми пробками. Контролем вэксперименте служат 3–5 пробирок, в каждую изкоторых вносят по 2 мл суспензии стандартногопродукта (количество азота также составляет 0,6 мг).Для инактивации посторонней микрофлоры опытныеи контрольные пробирки прогревают в воде притемпературе 80 °С в течение 20 мин.В пробирки с суспензией продукта послеохлаждения до температуры не выше 25 °С встерильных условиях вносят пастеровской пипеткойили дозатором по 0,2 мл 3–6-суточной культурыинфузорий Tetrahymena pyriformis, выращенных напептонной среде. Посевы оставляют в термостате при25 °С на 4–6 суток, ежедневно встряхивая по 3 разадля лучшей аэрации среды.Для исключения возможного токсическогодействия ежедневно из контрольных и опытныхпроб под микроскопом в «раздавленной капле»оценивают движение, размеры и морфологическиехарактеристики клеток инфузорий. По истечениипериода инкубирования клетки инфузорий обездви-живают фиксирующим раствором (йодный растворпо Бурке) и производят их подсчет в счетной камереГоряева.Результаты и их обсуждениеВсе продукты переработки сырья растительногопроисхождения подвержены ухудшению качества впроцессе обработки. Поэтому проблема микробнойконтаминации должна быть полностью решена.Выбираемый способ снижения уровня микробногозагрязнения должен быть максимально щадящим,чтобы не повлечь за собой нежелательные измененияв химическом составе и физических свойствах,влияющие на качество готового экстракта. Крометого, необходимо доказать отсутствие опасныхостаточных продуктов после применения того илииного способа деконтаминации.Так как вода представляет собой благоприятнуюсреду для развития микроорганизмов, то сроки условия хранения жидких экстрактов безконсервантов должны быть обоснованы иподтверждены данными по стабильности. Вданном исследовании микробиологический анализпроводился путем определения общего микробногочисла (ОМЧ) и количества плесневых грибов идрожжей.В таблице 1 приведены результаты микробиоло-гического анализа водного и сверхкритическогоСО2-экстракта гриба Inonotus obliquus. Полученныеданные для таких показателей, как ОМЧ и количествоплесневых грибов и дрожжей, показывают низкуюмикробную обсемененность водного экстрактаи микробную деактивацию сверхкритическогоСО2-экстракта.Производственный процесс полученияводного экстракта путем кипячения обеспечиваетснижение количества микроорганизмов. ДанныеТаблица 1. Микробиологические показатели экстрактов гриба Inonotus obliquusTable 1. Microbiological indicators of extracts of Inonotus obliquusПродолжительностьхранения экстракта,мес.Микробиологический показательОМЧ, КОЕ/мл Плесневые грибы и дрожжи, КОЕ/млводный экстракт сверхкритическийСО2-экстрактводный экстракт сверхкритическийСО2-экстракт0 4 0 3 06 4 0 5 012 5 0 4 018 8 0 5 024 8 2 8 030 12 0 11 036 10 0 15 0129Ли Н. Г. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 1 С. 125–133микробиологического анализа характеризуют низкуюобсемененность как на начальном этапе, так и в концеэксперимента: 4–10 КОЕ/мл. Однако указанныйспособ получения представляет эффективность вотношении вегетативных форм микроорганизмов,о чем свидетельствует увеличение количествамикроорганизмов во время хранения экстракта.В отличие от водного экстракта, полное удалениетаких контаминантов, как плесневые грибы идрожжи, отмечено для образца, полученного методомсверхкритической флюидной экстракции диоксидомуглерода (рис. 1). Представленные результатыиспытания образцов экстрактов и отсутствие ростана чашках Петри свидетельствуют о высокоймикробиологической чистоте сверхкритическогоСО2-экстракта гриба Inonotus obliquus, сохра-няющейся на протяжении всего срока хранения.Экстракция углерода диоксидом позволяетсократить общее количество аэробных микроорга-низмов и дрожжевых и плесневых грибов за счетсочетания действия растворителя с воздействиемвысокого давления, которые сокращают уровеньсодержания микроорганизмов.Механизм бактерицидного действия диоксидауглерода был описан авторами [10, 16, 17].Инактивацию микроорганизмов сверхкритическимдиоксидом углерода связывают с необратимымиповреждениями клеточной мембраны микроорга-низмов и инактивацией ключевых ферментовв клетке. Сжиженный диоксид углеродаобладает бактерицидными и антиоксидантнымисвойствами, что создает возможность извлечениятермо- и оксилабильных веществ, повышающихбиологическую ценность экстрактов. В процессехранения нами не наблюдалось увеличения уровнямикробной обсемененности в сверхкритическомСО2-экстракте, что показывает эффективностьинактивации как вегетативных, так и споровых форммикроорганизмов.Полученные результаты подтверждают бактери-цидные свойства экстрактов гриба Inonotus obliquusв отношении контаминирующей микрофлоры засчет содержания в своем компонентном составетритерпенового спирта – бетулина, обладающегоантибактериальными свойствами (рис. 2). Иденти-фикацию вещества проводили методом тандемноймасс-спектрометрии на масс-спектрометре«amaZon SL» («BRUKER DALTONIKS», Германия).В результате проведенного испытания образцовэкстрактов гриба Inonotus obliquus, полученныхводной и сверхкритической флюидной экстракцией,установлено, что в течение всего испытуемого срокахранения показатели, характеризующие микробнуюобсемененность экстрактов, оставались на низкомуровне. Также отмечена микробная деактивациядиоксидом углерода в сверхкритическом состоянииконтаминантов экстракта.Испытание полученных нами экстрактовберезового гриба Inonotus obliguus на токсичностьпроводили на суточной культуре инфузорийTetrahymena pyriformis. Оценивали следующие(а) (b)Рисунок 1. Чашки Петри с посевом сверхкритическогоСО2-экстракта гриба Inonotus obliquus (36 мес. хранения)на питательные среды (5-е сутки культивирования):a – ГРМ-агар; b – агар Сабуро с дектрозой ихлорамфинеколомFigure 1. Petri dishes with supercritical CO2-extract of Inonotusobliquus (36 months of storage) in nutrient media (5 daysof cultivation): a – GRM-agar; b – Sabouraud agar with dectroseand chlorampinecolРисунок 2. Масс-спектр бетулина, идентифицированного в сверхкритическом СО2-экстракте Inonotus obliquusFigure 2. Mass spectrum of betulin identified in supercritical CO2 extract of Inonotus obliquus130Li N.G. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 1, pp. 125–133признаки: поведение и характер роста клеток,подвижность, размер и форму клеток, замедлениероста, незначительные деформации инфузорийи число погибших клеток. В ходе экспериментаустановлено отсутствие угнетения подвижности ироста, форма клеток инфузорий овальная, ровная,деформация клеточных стенок не обнаружена. Этосвидетельствует об отсутствии токсичного действияисследуемых экстрактов. Как для опытных, так идля контрольного образцов, характерна активнаяподвижность инфузорий, отмечен положительныйфототаксис, гибель клеток не зафиксирована (рис. 3).Оценка степени токсичности экстрактов позволяетзаключить, что экстракты не оказывают токсичногодействия на живой организм и безопасны длявнесения в пищевые продукты.Для выявления возможного накоплениятоксического эффекта и отдаленных отрицательныхявлений воздействия экстрактов на организмпроводили дальнейшую инкубацию до 7 суток(168 ч). В течение всего срока инкубированиятоксического или мутагенного действия экстрактовна культуру инфузорий Tetrahymena pyriformis небыло выявлено. Результаты наблюдений отраженына рисунке 4. Наибольший прирост популяцииинфузорий наблюдался в образце с внесеннымсверхкритическим СО2-экстрактом гриба Inonotusobliguus.(а) (b) (c)Рисунок 3. Нативный препарат инфузорий Tetrahymena pyriformis в эксперименте исследования токсичности экстрактовгриба Inonotus obliguus (24 ч инкубирования): a – водный экстракт; b – сверхкритический СО2-экстракт;c – контроль физрастворFigure 3. Native preparation of ciliates Tetrahymena pyriformis in the toxicity test of Inonotus obliguus extracts (24 h of incubation):a – aqueous extract; b – supercritical CO2 extract; c – control salineРисунок 4. Рост тест-культуры инфузорий Tetrahymenapyriformis с добавлением экстрактов гриба Inonotus obliguusв эксперименте исследования токсичностиFigure 4. Test culture of Tetrahymena pyriformis after adding extractsof Inonotus obliguus during the toxicity testРисунок 5. Относительная биологическая ценность (ОБЦ)экстрактов гриба Inonotus obliguus (контроль – казеин)Figure 5. Relative biological value of Inonotus obliguus extracts(casein control)01234524 48 72 96 120 144 168Число клеток, едПродолжительность инкубирования, чконтроль (физраствор)водный экстрактсверхкритический CO2-экстракт144,4 139,296,55 82,34 76,2365,3251,1148,28 134,48 115,601002003004003-е сутки 4-е сутки 5-е сутки 6-е сутки 7-е суткиОБЦ, %Продолжительность инкубации, суткиводный экстракт сверхкритический CO2-экстракт01234524 48 72 96 120 144 168Число клеток, едПродолжительность инкубирования, чконтроль (физраствор)водный экстрактсверхкритический CO2-экстракт144,4 139,296,55 82,34 76,2365,3251,1148,28 134,48 115,601002003004003-е сутки 4-е сутки 5-е сутки 6-е сутки 7-е суткиОБЦ, %Продолжительность инкубации, суткиводный экстракт сверхкритический CO2-экстракт131Ли Н. Г. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 1 С. 125–133Для последующей оценки влияния экстрактовгриба Inonotus obliguus на биологическую ценностьбыло проведено определение относительнойбиологической ценности (ОБЦ) экстрактов гриба.В качестве контрольного образца был использованбелок казеин.Установлено, что ОБЦ экстрактов гриба Inonotusobliguus превышает показатель относительнойбиологической ценности стандартного белка –казеина (рис. 5). Набольший показатель ОБЦ уста-новлен для образца сверхкритического СО2-экстрактана 3-е сутки инкубации и превысил ОБЦ казеина на265,3 %. При рассмотрении динамики изменения ОБЦв течение эксперимента зафиксировано снижениепоказателя ОБЦ, по сравнению с контролем, какдля водного экстракта, так и для сверхкритическогоСО2-экстракта. Однако следует заметить, чтоснижение ОБЦ обусловлено общим снижениемчисла инфузорий в конце эксперимента, связанным срасходованием питательного субстрата.В результате оценки морфологическихпоказателей тест-объекта на зафиксированномпрепарате отмечены более крупные размеры клетокинфузорий, культивируемых в среде с добавлениемсверхкритического СО2-экстракта гриба Inonotusobliguus (рис. 6). Это связано с компонентнымсоставом СО2-экстракта термо- и оксилабильныесоединения которого оказывают стимулирующеевлияние на рост и размножение инфузорий в опытномобразце.ВыводыВ результате проведенного исследованияустановлено, что сверхкритическая флюиднаяэкстракция диоксидом углерода, по сравнению сводной экстракцией, способствует инактивациимикробных контаминантов исходного сырьягриба Inonotus obliguus и обеспечиваетстабильность показателей микробиологическойбезопасности полученного экстракта напротяжении представленного срока хранения.Водная экстракция представляет эффективность вотношении вегетативных форм микроорганизмов,о чем свидетельствует увеличение количествамикроорганизмов во время хранения экстракта. Втечение всего срока инкубирования токсическогоили мутагенного действия экстрактов на культуруинфузорий Tetrahymena pyriformis не былообнаружено. Высокий показатель ОБЦ и наибольшийприрост популяции инфузорий наблюдался в образцес внесенным сверхкритическим СО2-экстрактомгриба Inonotus obliguus.Таким образом, для испытуемых экстрактовгриба Inonotus obliguus характерна стабильность ипрослеживаемость микробиологических показателейв процессе хранения, отмечены высокие показателиОБЦ и установлена токсикологическая безопасностьметодом биотестирования на инфузории Tetrahymenapyriformis. Это позволяет использовать водныйи сверхкритический СО2-экстракты в качествекомпонентов пищевых систем.Критерии авторстваН. Г. Ли осуществляла планирование и постановкуэкспериментального исследования, проводилаанализ результатов и их статистическую обработку,формулировала выводы. Ею были написанытакие разделы статьи, как «введение», «объекты иметоды исследования» и «выводы». Т. К. Каленикосуществляла научное руководство исследования,обобщала полученные данные, выводилазакономерности и формулировала основные выводы.(а) (b) (c)Рисунок 6. Зафиксированный препарат инфузорий Tetrahymena pyriformis в эксперименте определения ОБЦ экстрактовгриба Inonotus obliguus: a – водный экстракт; b – сверхкритический СО2-экстракт; c – контроль казеинFigure 6. Fixed preparation of Tetrahymena pyriformis during the test in the relative biological value of Inonotus obliguus extracts:a – aqueous extract; b – supercritical CO2 extract; c – casein control03-е сутки 4-е сутки 5-е сутки 6-е сутки 7-е суткиПродолжительность инкубации, суткиводный экстракт сверхкритический CO2-экстракт132Li N.G. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 1, pp. 125–133Ею написаны раздел статьи «результаты и ихобсуждение» и откорректированы выводы.Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов, связанных с этой статьей.ContributionN.G. Li designed and organized the experimentalstudy, analyzed the results, statistically processed theobtained data, and formulated conclusions. N.G. Li is alsoresponsible for the Introduction, Objects and Methods,and Conclusions. T.K. Kalenik supervised the research,summarized the data, deduced patterns, and formulatedthe main conclusions. T.K. Kalenik wrote the Results andDiscussion paragraph and proofread the conclusions.Conflict of interestsThe authors declare that there is no conflict ofinterests related to the publication of this article.