DEPENDENCE OF GRIFOLA FRONDOSA EFFICIENCY ON PARTICLE SIZE OF LIGNOCELLULOSE SUBSTRATE
Rubrics: FOOD PRODUCTION TECHNOLOGY
Authors:
1.
Altai State University
Barnaul, Russian Federation
Barnaul, Russian Federation
2.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
3.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
4.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
Type:
Article
Pages:
from 24
to 30
Status:
Published
Received:
24.03.2017
Accepted:
24.03.2017
Published:
24.03.2017
Subject area:
UDK 57.083.182
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Language:
Russian
Keywords:
The degree of overgrowth, cell of growth, growth rate, primordial
Abstract (English):
The article is devoted to the actual problem of utilization of lignocellulose waste of woodworking industry and their use as substrates in the production of fruit bodies of saprotrophic fungi. The aim of the research was to study the efficiency of G. frondosa (Diks: Fr) Gray, cultivated on lignocellulose substrates with various degrees of grinding. The article describes the features of the formation of G. frondosa fruit bodies depending on cultivation conditions and the particle size of the lignocellulose substrate. To cultivate the fruit bodies of G. frondosa species favorable plant substrates based on woodworking industry and gardening waste have been developed. The optimum substrate for solid-phase cultivation of the G. frondosa mycelium is a sample №1 based on birch sawdust with a grinding degree of 5.0-10.0 mm. The dependence of the level of colonization of G. frondosa mycelium on time has been obtained. It is shown that substrates containing birch sawdust (griding 5.0-10.0 mm), birch chips (crushing 15.0-20.0 mm) and crushed sea buckthorn branch (degree of crushing 5.0-10.0 and 10.0-20.0 mm) are suitable for obtaining fruit bodies of G. frondosa. The first wave of fruiting exceeded the yield of the second wave by almost 2 times. The highest yield of G. frondosa - 268.01 g/kg of substrate - has been obtained using birch sawdust having a particle size of 5.0-10.0 mm, while the productivity of birch chips with a degree of crushing of 10.0-20.0 mm was 231.04 g/kg of substrate. The yield of G. frondosa cultivated on a substrate based on crushed buckthorn threads with the degree of crushing of 5.0-10.0 mm was 250.52 g/kg of substrate, while the productivity of the same substrate with a particle size of 10.0-20.0 mm was only 215.50 g/kg of substrate
The article is devoted to the actual problem of utilization of lignocellulose waste of woodworking industry and their use as substrates in the production of fruit bodies of saprotrophic fungi. The aim of the research was to study the efficiency of G. frondosa (Diks: Fr) Gray, cultivated on lignocellulose substrates with various degrees of grinding. The article describes the features of the formation of G. frondosa fruit bodies depending on cultivation conditions and the particle size of the lignocellulose substrate. To cultivate the fruit bodies of G. frondosa species favorable plant substrates based on woodworking industry and gardening waste have been developed. The optimum substrate for solid-phase cultivation of the G. frondosa mycelium is a sample №1 based on birch sawdust with a grinding degree of 5.0-10.0 mm. The dependence of the level of colonization of G. frondosa mycelium on time has been obtained. It is shown that substrates containing birch sawdust (griding 5.0-10.0 mm), birch chips (crushing 15.0-20.0 mm) and crushed sea buckthorn branch (degree of crushing 5.0-10.0 and 10.0-20.0 mm) are suitable for obtaining fruit bodies of G. frondosa. The first wave of fruiting exceeded the yield of the second wave by almost 2 times. The highest yield of G. frondosa - 268.01 g/kg of substrate - has been obtained using birch sawdust having a particle size of 5.0-10.0 mm, while the productivity of birch chips with a degree of crushing of 10.0-20.0 mm was 231.04 g/kg of substrate. The yield of G. frondosa cultivated on a substrate based on crushed buckthorn threads with the degree of crushing of 5.0-10.0 mm was 250.52 g/kg of substrate, while the productivity of the same substrate with a particle size of 10.0-20.0 mm was only 215.50 g/kg of substrate
Keywords:
The degree of overgrowth, cell of growth, growth rate, primordial
The degree of overgrowth, cell of growth, growth rate, primordial
Введение Одним из способов утилизации лигноцеллюлоз- ных отходов деревообрабатывающей промышленности и садоводства является использование их в качестве субстратов при производстве плодовых тел базидиомицетов, относящихся к сапротрофам [4, 6]. Сапротрофы - это грибы, обладающие ак- тивными полиферментными системами и состав- ляющие важное звено биологического распада ор- ганического вещества в природе. Они являются агентами биоконверсии таких сложных раститель- ных субстратов, как солома злаковых, гидролизный лигнин, отходы деревоперерабатывающей про- мышленности и т.п. Использование этих биологи- ческих агентов в утилизации отходов производств решает проблему безотходных технологий и преду- сматривает всестороннее детальное изучение как биотехнологических, так и медико-биологических проблем. В связи с этим перспективным биотехно- логическим процессом может являться твердофаз- ная ферментация растительных субстратов [4]. Твердофазное культивирование - это биотехно- логический процесс, который протекает в массе измельченного и влажного твердого субстрата. Субстрат может иметь различную форму и размеры частиц. Он должен содержать доступные питатель- ные вещества для роста микроорганизмов: целлю- лозу, крахмал, сахара в качестве источников угле- рода, аммиак, мочевину, белки в качестве источни- ков азота, минеральные соли. Субстрат может ис- пользоваться грибом полностью или частично. Независимо от варианта твердофазного культи- вирования субстрат не должен быть обделенным влажностью. Влага может пропитывать или образовывать пленку на его поверхности. Водные пленки могут быть различными в зависимости от свойств субстрата и потребностей используемого про- дуцента, и, следовательно, соотношение объемов твердой, водной и воздушной фаз может варьировать. Преимуществами твердофазного культивирова- ния перед жидкофазным можно считать следую- щие: 1) отдельные микробиологические процессы протекают в условиях твердофазной ферментации намного интенсивнее, чем в погруженной культуре; 2) твердофазные процессы менее энергоемки, трудоемки, материалоемки; 3) из-за низкого содержа- ния воды в ферментируемой массе твердофазное культивирование более рационально использует рабочее пространство; 4) уменьшение или полное исключение капитальных производственных за- трат, связанных с перемешиванием в ферментере для лучшей аэрации среды; 5) более низкая стои- мость при извлечении и высушивании конечного продукта; 6) условия, более приближенные к есте- ственным для роста лигнинразрушающих грибов. К недостаткам твердофазного культивирования необходимо отнести следующие: 1) большая часть микробиологических процессов в условиях твердофазного культивирования протекает медленнее; 2) контроль основных параметров ферментации сложнее или вообще невозможен из-за отсутствия водной фазы и гетерогенности среды. В настоящее время известны несколько техно- логических вариантов твердофазной ферментации, направленных на промышленное получение синте- зируемых микроорганизмами ферментов, биологи- чески активных веществ, антибиотиков и обога- щенных белком кормовых препаратов. Существуют следующие технологические варианты твердофаз- ной ферментации: твердофазная ферментация в перемешиваемом слое; твердофазная ферментация в аэрируемом слое; перемешиваемая глубинная твердофазная ферментация; псевдожидкая культу- ра; поверхностная твердофазная ферментация. Последний вариант твердофазной ферментации относится к самому простому. Он исключает при- нудительную аэрацию массы субстрата или его перемешивание. В качестве микроорганизмов- продуцентов в поверхностной твердофазной фер- ментации, как правило, используют грибы. Их раз- витие происходит в тонком (3-5 см) поверхностном слое субстрата. Этот метод ферментации применя- ется в развитых странах для биосинтеза различных ферментов, которые затем экстрагируются из вод- ной фазы. На рынке грибов нашей страны основное место занимают шампиньоны (Agaricus bisporus) и ве- шенка (Pleurotus ostreatus) [12]. В настоящее время перспективным направлени- ем представляется культивирование грибов G. frondosa, основными регионами обитания которых являются Япония, Китай и Корея. В этих странах гриб пользуется большим спросом и производится в промышленном масштабе [5, 6, 7]. Преимуществами вида G. frondosa перед други- ми культивируемыми грибами являются: высокая скорость роста мицелия; значительная конкуренто- способность по отношению к посторонней микро- флоре; способность утилизировать из разнообраз- ных растительных отходов сельского хозяйства и лесоперерабатывающей промышленности различ- ные углеродсодержащие соединения, в первую очередь целлюлозу и лигнин [2, 3, 6, 11]. К числу перспективных субстратов для культивирования G. frondosa можно отнести измельченные сучья и ветви деревьев, блоки из опилок дуба, бука и дру- гих пород, произрастающих в естественном ареале обитания этого гриба [1, 4, 8, 12]. Культивирование G. frondosa требует подбора температурно-влажностных режимов и рецептур субстратов [2, 9]. Целью работы являлось изучение продуктивно- сти культуры гриба G. frondosa, культивируемого на лигноцеллюлозных субстратах с различной сте- пенью измельчения. Объекты и методы исследований В ходе исследования использовали чистую культуру гриба G. frondosa (семейство Fomitopsidaceae), приобретенную через интернетмагазин (http://www.stolbovo.ru, 2006). Выращива- ние культуры осуществляли в чашках Петри методом поверхностного культивирования на суслоагаре при температуре 28 °C до полного зарастания мицелием питательной среды. Хранили культуру на скошенной сусло-агаровой среде в пробирках при температуре (4±1) °C. Биомассу мицелия получали в глубинных услови- ях на жидкой питательной среде состава: глюкоза - 1,0 %, пептон основной сухой - 0,5 %, КН2РО4 - 1,1 %, МgSO4×7Н2О - 0,1 %, Н2О (дистил.) - 97,3 %. Для культивирования использовали колбы емкостью 0,25 л с объемом среды 0,125 л. Стерилизацию питательной среды осуществляли автоклавированием при избыточном давлении 0,12 МПа в течение 30 мин. Для получения инокулята выращенный в чашках Петри на сусло-агаре мицелий вносили в кол- бы со стерильной жидкой средой и культивировали в стационарных условиях. Выращенный мицелий сте- рильно гомогенизировали и вносили в колбы для культивирования в количестве 10 %. Для получения биомассы мицелия в глубинных условиях культивирование проводили на ротаци- онной качалке (Шейкер термостатируемый BioSan ES-20) при скорости вращения 150 об/мин и темпе- ратуре 28 °C. В качестве растительных субстратов использо- вали березовые опилки (степень измельчения 5,0- 10,0 мм), березовую стружку (степень измельчения 15,0-20,0 мм) и дробленые ветки облепихи (степень измельчения 5,0-10,0 и 15,0-20,0 мм) (табл. 1). Дробленые ветки облепихи получали на садовом измельчителе Sturm GBE 2400 C. В вышеперечисленные субстраты добавляли пшеничные отруби - 6,8 %, глюкозу - 0,2 %, СаСО3 - 0,4 %, KН2PO4 - 0,2 %, MgSO4×7H2O - 0,2 % и воду - 64,2 %. Составы растительных субстратов для культивирования культуры гриба G. frondosa Таблица 1 Рецептурные компоненты Массовая концентрация компонентов, % образец № 1 образец № 2 образец № 3 образец № 4 Березовые опилки (степень измельчения5,0-10,0 мм) 28,0 - - - Дробленые ветки облепихи (степеньизмельчения 5,0-10,0 мм) - 28,0 - - Березовая стружка (степень измельче-ния 10,0-20,0 мм) - - 28,0 - Дробленые ветки облепихи (степеньизмельчения 10,0-20,0 мм) - - - 28,0 Субстрат помещали в стеклянные банки (ГОСТ 5717.2-2003) объемом 1 л и проводили автоклави- рование при избыточном давлении 0,12 МПа в те- чение 90 мин. Субстрат охлаждали до 25 С и про- изводили его инокуляцию глубинным мицелием. Посевной мицелий вносили в количестве 10 % от массы субстрата. Для вентиляции и предотвраще- ния высыхания мицелия на поверхности субстрата образцы накрывали крышками из полиэтилена с фильтром (Агроспан 42). Подготовленные образцы помещали в термостат при температуре 28 °С до полного зарастания субстрата мицелием. Для определения степени зарастания субстрата мицелием использовали весовой метод измерения. Биомассу мицелия в образцах отделяли отсеивани- ем и высушивали в сушильном шкафу «СНОЛ-3.5» при температуре 105 °С до постоянной массы. От- сеивание и высушивание мицелия проводили каж- дые 2 суток до полного зарастания субстрата мице- лием. Для проведения эксперимента использовали 45 образцов. После полной колонизации субстрата мицели- ем G. frondosa во всех образцах крышки с филь- тром удаляли, поверхность субстрата срезали (слой 10 мм), затем помещали в камеру роста с регулируемым режимом выращивания: темпера- тура 18 °С, освещение (350 люкс) в течение 12 часов в сутки и относительная влажность воз- духа (85±5) %. Эксперимент осуществляли в трехкратной по- вторности. Статистическая обработка данных про- водилась с использованием компьютерной про- граммы Microsoft Excel 2010. Результаты и их обсуждение Проведенные исследования показали, что сте- пень зарастания субстрата мицелием G. frondosa зависит от состава лигноцеллюлозного субстрата и степени измельчения компонентов. На рис. 1 пред- ставлен график, отражающий зависимость степени зарастания субстрата мицелием от времени. Рис. 1. Динамика образования мицелия G. frondosa на субстратах разного состава Из данных рис. 1 следует, что на всех исследуе- мых субстратах наблюдался хороший рост мицелия G. frondosa. Однако наиболее высокая колонизация субстрата мицелием происходила в образце № 1, в качестве основного компонента которого использова- ли березовые опилки, где полное зарастание было зафиксировано на 17-е сутки культивирования. И не- сколько позже - на субстрате с березовой стружкой и дроблеными ветками облепихи (степень измельчения 5,0-10,0 мм): на 21 и 23-и сутки соответственно. Об- разцы № 2 и № 4 по длительности колонизации суб- страта мицелием отличались несущественно. Было показано, что для развития мицелия при- годны лигноцеллюлозные субстраты, в качестве основных компонентов которых использовали дре- весину березы и облепихи. Степень измельчения этих компонентов создавала благоприятные усло- вия для развития мицелия. Появление первых примордиев в образцах № 1 и № 2 было отмечено на 5-е сутки эксперимента в камере роста, а в образцах № 3 и № 4 - на 7 и 8-е сутки соответственно (рис. 2). При этом их форми- рование происходило в течение 3 суток во всех об- разцах. а б в г Рис. 2. Формирование примордиев G. frondosa на 8 сутки эксперимента в камере роста: а - образец № 1; б - образец № 2; в - образец № 3; г - образец № 4 Число сформировавшихся примордиев в об- разце № 2 составляло около 70 штук, в то время как в образцах № 1, № 3 и № 4 их количество было меньше, около 30 штук. Первая волна плодоношения была отмечена на 15-е сутки экспе- римента в камере роста в образцах № 1 и № 3, а в образцах № 2 и № 4 - на 17-е сутки культивиро- вания (рис. 3). а б в г Рис. 3. Формирование плодовых тел в стеклянной банке объемом 1 дм3 на 15-е сутки эксперимента в камере роста: а - образец № 1; б - образец № 2; в - образец № 3; г - образец № 4 Вторая волна образования плодовых тел наблю- далась на 21-е сутки инкубации в камере роста по- сле выгонки плодовых тел с первой волны. Третья волна плодоношения происходила на 31-е сутки инкубации. Существенных различий между исследуемыми образцами по времени появления примордиев и длительности созревания плодовых тел не обнаружено. Первая волна плодоношения превышала уро- жайность второй волны почти в 2 раза. Наибольшая урожайность G. frondosa получена в варианте с ис- пользованием березовых опилок со степенью из- мельчения 5-10 мм и составляла 268 г/кг субстрата, в то время как на березовой стружке со степенью измельчения 10-20 мм - 231 г/кг субстрата. На суб- страте, в качестве основного компонента которого использовались дробленые ветки облепихи со сте- пенью измельчения 5-10 мм, урожайность состав- ляла 250 г/кг субстрата, а со степенью измельчения 10-20 мм - 215 г/кг субстрата. На основании полученных данных установлено, что лигноцеллюлозные субстраты из древесины березы и облепихи являются пригодными для по- лучения плодовых тел грибов вида G. frondosa. Грибы минимального размера имели следую- щие средние параметры: масса - 6,44 г, длина нож- ки - 35 мм, диаметр шляпки - 10 мм. Грибы макси- мального размера: масса - 79,65 г, длина ножки - 60 мм, диаметр шляпки - 110 мм (рис. 4). Культура гриба G. frondosa давала до трех волн плодовых тел. Выход грибов в зависимости от вол- ны плодоношения представлен на рис. 5. а б Рис. 4. Линейные размеры плодовых тел G. frondosa: а - плодовое тело минимального размера; б - плодовое тело максимального размера Рис. 5. Выход грибов от массы субстрата Из рис. 5 видно, что во всех исследуемых расти- тельных субстратах с различной степенью измель- чения в первой волне плодоношения наблюдался наибольший выход грибов от массы субстрата. Таким образом, в результате исследований было установлено, что оптимальным субстратом для раз- вития мицелия G. frondosa является образец № 1, основным компонентом которого являются березо- вые опилки со степенью измельчения 5,0-10,0 мм. На всех остальных субстратах колонизация проис- ходит в более длительный срок. Однако для получения плодовых тел благоприятными являются все исследованные субстраты. В процессе эксперимента было отмечено, что снижение относительной влажности воздуха до 70 % и ниже приводило к деформации плодовых тел. При температуре воздуха более 15 С наблю- дался интенсивный рост плодовых тел с отклоне- ниями по внешнему виду и размеру, грибы имели мелкие, быстро раскрывающиеся шляпки и удли- ненные тонкие ножки. Пониженная температура способствовала образованию плодовых тел с крупными, плотными, долго не раскрывающимися шляпками и короткими толстыми ножками. При недостаточном освещении появлялись деформиро- ванные плодовые тела: шляпка маленькая, недораз- витая, ножка длинная. Заключение Для выращивания плодовых тел вида G. frondosa разработаны благоприятные раститель- ные субстраты с использованием отходов дерево- обрабатывающей промышленности и садоводства. Наиболее оптимальным субстратом для твердофазного культивирования мицелия G. frondosa яв- ляется образец № 1, в качестве основы которого использовались березовые опилки со степенью из- мельчения 5,0-10,0 мм. Получена зависимость степени зарастания суб- стратов мицелием G. frondosa от времени. Показано, что для получения плодовых тел frondosa пригодны субстраты, основными ком- понентами которых являются березовые опилки (степень измельчения 5,0-10,0 мм), березовая стружка (степень измельчения 15,0-20,0 мм) и дробленые ветки облепихи (степень измельчения 5,0-10,0 и 15,0-20,0 мм). Первая волна плодоношения превышала уро- жайность второй волны почти в 2 раза. Наибольшая урожайность G. frondosa получена в варианте с ис- пользованием березовых опилок со степенью из- мельчения 5-10 мм и составляла 268 г/кг субстрата, в то время как березовая стружка со степенью из- мельчения 10-20 мм - 231 г/кг субстрата. На суб- страте, в качестве основного компонента которого использовались дробленые ветки облепихи со сте- пенью измельчения 5-10 мм, урожайность состав- ляла 250 г/кг субстрата, а со степенью измельчения 10,0-20,0 мм - 215 г/кг субстрата. Показано, что степень измельчения раститель- ного материала повлияла на развитие мицелия и выход урожая грибов G. frondosa. Во всех исследуемых растительных субстратах с различной степенью измельчения в первой волне плодоношения наблюдался наибольший выход грибов от массы субстрата.
1. Il'ina, G.V. Biologicheskie osobennosti vidov ksilotrofnyh bazidiomicetov lesostepi Pravoberezhnogo Povolzh'ya insitu i exsitu / G.V. Il'ina, Yu.S. Lykov // Povolzhskiy ekologicheskiy zhurnal. - 2010. - № 3. - S. 263-273.
2. Zaikina, N.A. Osnovy biotehnologii vysshih gribov / N.A. Zaikina, A.E. Kovalenko. - SPb: Izd-vo SPBHFI, 2007. - 336 s.
3. Minakov, D.V. Izuchenie processa kul'tivirovaniya kul'tury griba Grifola frondosa / D.V. Minakov, A.I. Shadrinceva // Aktual'nye problemy sohraneniya i razvitiya biologicheskih resursov. - Ekaterinburg, 2015. - S. 230-234.
4. Muradov, P.Z. Osnovy biokonversii rastitel'nyh substratov / P.Z. Muradov. - Baku: Elm, 2003. - 114 s.
5. Volchatova, I.V. Ispol'zovanie gribov dlya udaleniya drevesnyh ostatkov v usloviyah urbanizovannyh ekosistem / I.V. Volchatova, S.A. Medvedeva // Uspehi medicinskoy mikologii. - 2006. - № 7. - S. 234-235.
6. Garibova, A.V. Osnovy mikologii. Morfologiya i sistematika gribov i gribopodobnyh organizmov / A.V. Garibova, S.N. Lekomceva. - M.: Tovarischestvo nauchnyh izdaniy KMK, 2005. - 207 s.
7. Gornova, I.B. Ispol'zovanie vidimogo cveta v biotehnologii / I.B. Gornova // Sovremennaya mikologiya v Rossii. Pervyy s'ezd mikologov. - M., 2002. - S. 294-295.
8. Belova, N.V. Priroda biologicheskoy aktivnosti vysshih gribov / N.V. Belova // Uspehi medicinskoy mikologii. - 2006. - № 1. - S. 230-233.
9. Il'ina, G.V. Ksilotrofnye bazidiomicety v chistoy kul'ture: monografiya / G.V. Il'ina, D.Yu. Il'in. - Penza: Izd-vo Penz. un-ta, 2013. - 206 s.
10. Buhalo, A.S. Kul'tivirovanie s'edobnyh i lekarstvennyh gribov. Prakticheskie rekomendacii / A.S. Buhalo. - Kiev: Naukova dumka, 2004. - 128 s.
11. Shen, Q. Effects of nutrient supplements on biological efficiency, quality and crop cycle time of maitake («Grifola frondosa») / Q. Shen, D. Royse // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2001. - Vol. 57. - P. 74-78.
12. Mayuzumi, Y. Cultivation Methods of Maitake («Grifola frondosa») / Y. Mayuzumi, T. Mizuno // Food Reviews International. - 1997. - Vol. 13. - P. 357-364.
