employee
Stavropol', Stavropol, Russian Federation
employee
Stavropol', Stavropol, Russian Federation
employee
Stavropol', Stavropol, Russian Federation
Sheep’s milk contains fatty acids that have a positive effect on human health. Besides, its production is economically profitable. Thus, fatty-acid profile of cheese and its transformation during maturing remain relevant for scientific research. The present research featured the quality of lipids during the fatty phase of soft-ripened Camembert-type cheese. Its fatty-acid profile was studied using a method of gas chromatography. A set of experiments established significant changes in the concentration of fatty acids during maturing. The concentration of short chain fatty acids increased, namely that of butyric acid (C4:0), butylacetic acid (C6:0), and hexylacetic acid (C8:0). The trend can be associated with the specific lipases produced by microorganisms during ripening. On day 14, the concentration of lauric acid (C12:0) increased by 30% and that of myristic acid (C14:0) – by 13%, as compared with day 1. The initial concentration of 18:1n9t isomer was about 70% of the total amount of trans-isomers of fatty acids. After maturing, its concentration decreased by 98%. The concentration of C10:0, C14:0, C16:0, C18:0, C18:1t11, and C18:1c9 fatty acids equaled 73% of the total amount of fatty acids during all periods of ripening. The concentration of hypercholesterolemic fatty acids increased and that of hypocholesteremic fatty acids decreased during ripening, which raised the Atherogenic and thrombogenic indices. Fatty acids with ≤ 12 carbon atoms were found characteristic of fatty acid profile of sheep’s milk Camembert. They can be used to detect other milk in sheep’s milk cheese.
Cheese, technology, lipids, fatty acids, maturing
Введение
Молочный жир является основным компонентом
большинства сортов сыра. Из-за этого многие потре-
бители ограничивают потребление сыра, т. к. более
60 % от общего количества жирных кислот в молоч-
ном жире составляют насыщенные жирные кислоты.
Потребление молочных продуктов с низким содержа-
нием жиров в последние годы становится все более
популярным среди потребителей, заботящихся о
своем здоровье. Это привело к разработке новых мо-
лочных продуктов c улучшенным жирнокислотным
составом [1, 4, 8, 11, 12, 19]. Однако снижение жира
представляет собой сложную проблему, поскольку
жир важен для текстуры и вкуса молочных продук-
тов, таких как сыр [2]. Уменьшение жира в сырах
приводит к нежелательной текстуре, отсутствию
характерного вкуса или наличию посторонних арома-
тов. Поэтому актуальным является исследование тех-
нологических процессов, формирующих сенсорные
качества сыров [13, 14, 17].
Белая тонкая корочка с поверхностной плесенью
Penicillium camemberti образует сложную экоси-
стему. Для производства сыра типа камамбер из
пастеризованного молока применяются Penicillium
camemberti, Geotrichum candidum. Мягкие сыры, со-
зревающие с участием поверхностной микрофлоры,
образует сложную экосистему, которая не была хоро-
шо изучена. Более того, липолитическая активность
поверхностной микрофлоры приводит к типичным
сенсорным свойствам сыра. Короткоцепочечные
жирные кислоты вносят непосредственный вклад в
органолептические характеристики сыров [15, 16].
В научной литературе представлены результаты
исследований, посвящённых изучению концентра-
ции жирных кислот в сырах из коровьего молока, но
практически отсутствует информации об изменении
жирнокислотного профиля сыров из овечьего молока
в процессе созревания [3, 5, 7, 9, 10, 18, 20, 21].
Таким образом, целью данного исследования ста-
ло изучение жирнокислотного состава жировой фазы
сыров типа камамбер из овечьего молока в процессе
созревания. Результаты могут стать основой для раз-
работки инструментов и стратегий сравнительного
анализа, направленного на улучшение пищевых ха-
рактеристик сыра из овечьего молока.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования стал мягкий сыр типа
камамбер из овечьего молока, пастеризованного при
63 °C в течение 30 минут перед изготовлением с при-
менением культур Penicillium camemberti, Geotrichum
candidum, а также Lactococcus lactis, Lactococcus
cremoris, Lactococcus diacetylactis, Leuconostoc
mesenteroides ssp. сremoris. В дозу, обеспечивающую
общую продолжительность свертывания в течение
30–45 мин, были внесены хлористый кальций и сы-
чужный фермент. Перед формованием производи-
лась разрезка сгустка на кубики с размером сторон
1–1,5 см и вымешиванием сырного зерна. Затем про-
водилось формование, самопрессование и созревание
при температуре 8 ± 2 °С в течении 14 суток.
Исследование жирнокислотного состава в сыре в
процессе созревания с применением метода газовой
хроматографии проводили в соответствии с государ-
ственным отраслевым стандартом Российской Феде-
рации 32915-2014 «Молоко и молочная продукция.
Определение жирнокислотного состава жировой
фазы методом газовой хроматографии».
Для оценки показателей качества липидов жи-
ровой фазы сыра типа камамбер выполнен расчет
индекса атерогенности и тромбогенного индекса по
формулам [6]:
(1)
(2)
Результаты и их обсуждение
Липиды в пищевых продуктах могут подвергаться
гидролитической или окислительной деградации.
Однако в сыре окислительные изменения очень
ограничены из-за низкого окислительно-восста-
новительного потенциала. Триглицериды во всех
разновидностях сыра подвергаются гидролизу под
действием эндогенных или экзогенных липаз. Это
приводит к выделению жирных кислот в сыре во
время созревания. Триглицериды молочного жира
жвачных животных богаты короткоцепочечными
жирными кислотами, которые при высвобождении
имеют низкие пороги вкуса и вносят значительный
вклад в аромат многих сортов сыра.
Приемлемость сенсорных характеристик сыра во
многом зависит от вкуса, который образуется при
созревании. Двумя важными классами соединений,
способствующие приданию вкуса, являются летучие
соединения серы и жирные кислоты. Свободные жир-
ные кислоты способствуют формированию вкуса и
аромата сыра.
compared with day 1. The initial concentration of С18:1n9t isomer was about 70% of the total amount of trans-isomers of fatty acids.
After maturing, its concentration decreased by 98%. The concentration of C10:0, C14:0, C16:0, C18:0, C18:1t11, and C18:1c9 fatty
acids equaled 73% of the total amount of fatty acids during all periods of ripening. The concentration of hypercholesterolemic fatty
acids increased and that of hypocholesteremic fatty acids decreased during ripening, which raised the Atherogenic and thrombogenic
indices. Fatty acids with ≤ 12 carbon atoms were found characteristic of fatty acid profile of sheep’s milk Camembert. They can be
used to detect other milk in sheep’s milk cheese.
Keywords. Cheese, technology, lipids, fatty acids, maturing
For citation: Voblikova TV, Sadovoy VV, Barybina LI. Sheep’s Milk Camembert Ripening: Transformation of Fatty-Acid Profile. Food Processing:
Techniques and Technology. 2019;49(3):423–430. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.21603/2074-9414-2019-3-423-430.
425
Вобликова Т. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2019. Т. 49. № 3 С. 423–430
Липолиз является одним из основных биохимиче-
ских процессов, который способствуют развитию вкуса
во время созревания сыра. Характерный вкус мягких
сыров, таких как камамбер особенно из овечьего мо-
лока, формируется в значительной степени в резуль-
тате воздействия на жировую фазу плесени Penicíllium
camemberti. Исследовано влияние заквасочных культур
Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Lactococcus
diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. сremoris,
Penicillium camemberti и Geotrichum candidum на изме-
нение профиля жирных кислот в сыре типа камамбер.
Профиль жирных кислот в процессе созревания сыра
существенно изменялся (рис. 1).
Коротокоцепочечные свободные жирные кислоты
вносят свой вклад в конечные вкусовые характери-
стики сыра. В таблице 1 представлена динамика изме-
нения состава жирных кислот в процессе созревания.
Отмечено увеличение концентрации коротокоцепо-
чечных жирных кислот: масляной (C4:0) капроновой
(C6:0), каприловой (C8:0). Установленная тенденция
увеличения концентрации масляной, капроновой, и
каприловой кислот во время созревания может быть
связана со специфичностью липаз продуцируемых
микроорганизмами, участвующими в процессе со-
зревания сыра. На 14 день созревания концентрация
лауриновой кислоты (С12:0) увеличилась на 30 %, ми-
ристиновой кислоты (C14:0) – на 13 % по сравнению
с исходной концентрацией в начале срока созревания.
В таблице 2 представлено изменение состава
мононенасыщенных жирных кислот сыра типа ка-
мамбер из овечьего молока в процессе созревания.
Наиболее распространенным трансизомером C18:1
является С18:1n9t, который составляет 60–80 % от
общего количества трансизомеров жирных кислот. В
процессе созревание концентрация С18:1n9t умень-
шается на 98 %. Это снижает риск негативного воз-
действия трансизомеров на организм человека.
(а) (б)
Рисунок 1. Изменение жирнокислотного профиля мягкого сыра типа камамбер из овечьего молока в процессе созревания:
(а) без созревания; (б) срок созревания 14 суток
Figure 1. Changes in the fatty acid profile of soft sheep’s milk Camembert during ripening: (a) before ripening; (b) day 14
Таблице 1. Влияние процесса созревания на содержание
насыщенных жирных кислот в сыре из овечьего молока,
выработанного по типу камамбера, %
Table 1. Effect of ripening on the concentration of saturated fatty acids
in sheep’s milk Camembert-type cheese, %
Жирная кислота Срок созревания сыра
без созревания 7 суток 14 суток
С4:0 2,532 3,459 5,227
С6:0 2,836 3,767 5,806
С8:0 2,842 2,913 4,824
С10:0 7,272 6,230 10,439
С11:0 0,158 0,291 0,354
С12:0 3,539 3,642 4,811
С13:0 0,070 0,083 0,092
С14:0 8,323 8,768 9,445
C15:0 0,918 1,001 1,068
С16:0 22,688 24,715 18,285
С17:0 1,092 0,612 0,662
С18:0 13,804 10,239 11,172
C20:0 0,007 0,005 0,001
С21:0 0,609 0,740 0,862
С22:0 0,041 0,069 0,117
С23:0 0,009 0,009 0,022
С24:0 0,002 0,047 0,019
Σ насыщенные
жирные кислоты
66,742 66,590 73,206
Таблица 2. Влияние процесса созревания на содержание
мононенасыщенных жирных кислот в сыре из овечьего
молока, выработанного по типу камамбера, %
Table 2. Effect of ripening on the concentration
of monounsaturated fatty acids in cheese from sheep milk
in sheep’s milk Camembert-type cheese, %
Жирная кислота Срок созревания сыра
без
созревания
7 суток 14 суток
С14:1n5-c9 0,449 0,676 0,562
C15:1n6-c9 0,333 0,312 0,316
С16:1n7-c9 0,523 1,080 0,643
С17:1n8-c9 0,379 0,235 0,236
С18:1n9t 2,055 1,029 0,023
С18:1n9c 23,836 23,407 19,461
C20:1 1,033 0,512 0,990
С22:1n9-с13 0,007 0,018 0,031
С24:1 0,036 0,306 0,608
ΣMUFA
(мононенасыщенных)
28,651 27,575 22,870
426
Voblikova T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2019, vol. 49, no. 3, pp. 423–430
В результате анализа данных, представленных
в таблице 2, можно отметить, что происходит сни-
жение концентрации мононенасыщенных жирных
кислот в процессе созревания. Отмечено сниже-
ние концентрации цис-изомера олеиновой кисло-
ты (С18:1n9c) на 18 %.
К концу срока созревания происходит снижение
концентрации полиненасыщенных жирных кислот на
14 %. Однако необходимо отметить повышение кон-
центрации линолевой кислоты.
В результате анализа изменений жирнокислот-
ного профиля в процессе созревания сыра камамбер
установлено, что независимо от периода созревания
жирные кислоты C10:0, C14:0, C16:0, C18:0, C18:1t9
и C18:1c9 составляют около 73 % от суммы всех
жирных кислот. На рисунке 2 представлены данные
по изменению профиля жирных кислот C10:0, C14:0,
C16:0, C18:0, C18:1t11 и C18:1c9 в процессе созрева-
ния сыра.
Данные представленные на рисунке 2 свидетель-
ствуют о том, что при созревании сыра происходит
существенное изменение концентрации короткоцепо-
чечных насыщенных жирных кислот, формирующих
органолептические особенности сыра.
На рисунке 3 представлено изменение соотно-
шения жирных кислот в процессе созревания сыра.
Суммы жирных кислот во всех образцах уменьша-
лись в порядке: насыщенные жирные кислоты >
мононенасыщенные жирные кислоты > полинена-
сыщенные жирные кислоты. Индекс атерогенности
находится в тесной взаимосвязи с качественным и
количественным составом жирных кислот. Отмеча-
ется положительная корреляция между рассматри-
ваемыми переменными, т. е. увеличение в молоке
миристиновой (С:14) и пальмитиновой (С:16) кислот
приводит к увеличению индекса атерогенности. От-
рицательной корреляции между суммой ненасыщен-
ных жирных кислот с длинными цепями и индексом
атерогенности. Индекс атерогенности снижается при
увеличении содержания ненасыщенных жирных кис-
лот с длинными цепями (Σ С:18; С:20; С:22) в соста-
ве жировой фазы мягкого сыры из овечьего молока.
Основными видами жирных кислот ω-3, ис-
пользуемых организмом, являются: α-линоленовая
кислота (C18:3n-3, αLA), эйкозапентаеновая кислота
(C20:5n-3), докозапентаеновая кислота (C22:5n-3)
и докозагексаеновой кислоты (C22:6n-3). Пищевые
рекомендации основаны на различных соотноше-
ниях, таких как ω-3 полиненасыщенные жирные
Таблица 3. Влияние процесса созревания на содержание
полиненасыщенных жирных кислот в сыре из овечьего
молока, выработанного по типу камамбера, %
Table 3. Effect of ripening on the concentration of polyunsaturated fatty
acids in sheep’s milk Camembert-type cheese, %
Жирная кислота Срок созревания сыра
без созревания 7 суток 14 суток
С18:2n6 0,256 0,326 0,457
С18:2n6c 3,453 4,328 1,910
С18:3n3-t-9,t-12,t-15 0,025 0,034 0,034
С18:3n6-C6,C9,C12 0,003 0,069 0,133
С18:3n3-t-9, t-12,c-15 – – –
С18:3n3-c-9,t-12,t-15
+ С18:3n3-t-9,c-
12,c-15
0,398 0,360 0,410
С18:3n3-c-9,t-12,c15 0,015 – 0,026
С18:3n6-C9,C12,C15 – 0,132 0,132
С20:2 0,075 0,068 0,135
С20:3n6-C8,C11,C14 0,050 0,027 0,040
С20:3n3-C8,C11,C14, 0,224 0,332 0,499
С20:4n6-C8,C11,C14,
С17
0,022 0,029 0,031
С22:2n6-с13,16 0,014 0,049 0,075
С20:5n3-
C5,С8,C11,C14,17
0,006 0,032 0,018
С22:6n3-
C4,С7,10,13,16,19
0,066 0,049 0,024
Σ полиненасыщен-
ные жирные кислоты
4,607 5,835 3,924
(а) (б)
Рисунок 2. Профиль жирных кислот жировой фазы сыра типа камамбер в процессе созревания:
(а) без созревания (б) срок созревания 14 суток
Figure 2. Fatty acid profile of sheep’s milk Camembert-type cheese during ripening: (a) before ripening (b) day 14
0 5
10
15
20
25
С4:0
С6:0
С8:0
С10:0
С14:0
С16:0
С18:1t
C18:1с
а
0
5
10
15
20
С4:0
С6:0
С8:0
С10:0
С14:0
С16:0
С18:1t
C18:1с
б
40
60
80
0 5
10
15
20
25
С4:0
С6:0
С8:0
С10:0
С14:0
С16:0
С18:1t
C18:1с
а
0
5
10
15
20
С4:0
С6:0
С8:0
С10:0
С14:0
С16:0
С18:1t
C18:1с
б
40
60
80
427
Вобликова Т. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2019. Т. 49. № 3 С. 423–430
кислоты/ω-6 полиненасыщенные жирные кислоты и
полиненасыщенные жирные кислоты/насыщенные
жирные кислоты. Эти значения используются для
оценки питательной ценности жира для потребле-
ния человеком. Здоровая диета должна содержать
примерно в 4 раза больше ω-6 жирных кислот, чем
ω-3 жирных кислот. Соотношение ω-6/ω-3 является
важным определяющим фактором для снижения
риска многих хронических заболеваний. В таблице 4
представлены данные по пищевой ценности липидов
в сыре типа камамбер из овечьего молока.
В процессе созревания происходит изменение
соотношения ω-3 и ω-6 полиненнасыщенных жир-
ных кислот. Происходит снижением концентрации
ω-6 полиненнасыщенных жирных кислот и с одно-
временным увеличением концентрация ω-3 полине-
насыщенных жирных кислот. Полученные данные
свидетельствуют о возможности направленного
регулирования жирнокислотного профиля сыров в
процессе созревания.
Выводы
Исследованы закономерности, характеризующие
процесс трансформации состава жирных кислот при
созревании сыра типа камамбер из овечьего молока.
Установлено, что независимо от периода созревания
жирные кислоты C10:0, C14:0, C16:0, C18:0, C18:1t11
и C18:1c9 составляли около 73 % от суммы всех жир-
ных кислот. К концу срока созревания происходит
снижение концентрации полиненасыщенных жирных
кислот на 14 %. Увеличение в процессе созревания
сыра концентрации гиперхолестеринемических и
снижение гипохолестеринемических жирных кислот
оказало влияние на увеличение индекса атероген-
ности и тромбогенного индекса. Установлено, что
жирные кислоты с менее чем двенадцатью атомами
углерода характеризуют особенность жирнокислот-
ного состава жировой фазы овечьего молока и могут
быть использованы для обнаружения в сыре замены
овечьего молока молоком других видов животных.
Результаты данного исследования могут стать ос-
новой для разработки инструментов и стратегий
сравнительного анализа, направленных на улучшение
пищевых характеристик овечьего сыра.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта инте-
ресов
Благодарности
Выражаем благодарность за помощь в подготовке
статьи ректору ФГБОУ ВО «Ставропольский госу-
дарственный аграрный университет», академику РАН
Трухачеву Владимир Ивановичу, директору Все-
российского научно-исследовательского института
овцеводства и козоводства – филиал Федерального
государственного бюджетного научного учреждения
«Северо-Кавказский федеральный научный аграрный
центр», доктору биологических наук, профессору Се-
лионовой Марине Ивановне.
Финансирование
Научно-исследовательская работа выполнена
в рамках контракта ФГБОУ ВО «Ставропольский
государственный аграрный университет» с Мини-
стерством сельского хозяйства Ставропольского края
199/16 от 02.09.2016.
1. Gurʹyanova LV, Matveeva AA. Ispolʹzovanie dobavok rastitelʹnogo proiskhozhdeniya v proizvodstve plavlenykh syrov [Plant additives in processed cheese production]. Aktualʹnye voprosy sovershenstvovaniya tekhnologii proizvodstva i pererabotki produktsii selʹskogo khozyaystva [Relevant Issues of Improving the Technology of Production and Processing of Agricultural Products]. 2018;(20):278-280. (In Russ.).
2. Mordvinova VA, Lepilkina OV, Ostrouhova IL, Samoilov AV. Special features of formation of the organoleptic indices of cheese products. Magazine cheesemaking and buttermaking. 2012;(2):31-33. (In Russ.).
3. Orluk UT, Stepanischev MI. The research of proteolysis and lipolysis in cheeses with mold. Food Processing: Techniques and Technology. 2013;30(3):45-48. (In Russ.).
4. Konopleva GF, Lapshina LV. Zamenitelʹ molochnogo zhira - produkt zdorovogo pitaniya [Milk fat substitute as a product of healthy nutrition]. Milk Processing. 2015;192(10):80-83. (In Russ.).
5. Vlasova JA, Kochieva AA, Vlasov NYu. Fatty acids composition of the cheese with spices and aroma plants. Magazine cheesemaking and buttermaking. 2013;(4):18-19. (In Russ.).
6. Ulbrich TLV, Southgate DAT. Coronary heart disease seven dietary factors. The Lancet. 1991;338(8773):985-992. DOI: https://doi.org/10.1016/0140-6736(91)91846-M.
7. Gorbatova KK, Gunʹkov PI. Biokhimiya moloka i molochnykh produktov [Biochemistry of milk and dairy products]. St. Petersburg: GIORD; 2010. 336 p. (In Russ.).
8. Bakeet ZAN, Alobeidallah FMH, Arzoo S. Fatty acid composition with special emphasis on unsaturated trans fatty acid content in margarines and shortenings marketed in Saudi Arabia. International Journal of Biosciences. 2013;3(1):86-93.
9. Scerra M, Chies L, Caparra P, Cilione C, Foti F. Effect of Only Pasture on Fatty Acid Composition of Cow Milk and Ciminà Caciocavallo Cheese. Journal of Food Research. 2016;5(3):20-29. DOI: https://doi.org/10.5539/jfr.v5n3p20.
10. Shahein MR, Soliman ES. Fatty Acids and Amino Acids Composition of Milk and Resultant Domiati Cheese Produced from Lactating Cows Fed Different Energy and Protein Sources Rations. World Journal of Dairy and Food Sciences. 2014;9(2):184-190. DOI: https://doi.org/10.5829/idosi.wjdfs.2014.9.2.8624.
11. Hayaloglu AA, Yasar K, Tölü C, Sahingil D. Characterizing volatile compounds and proteolysis in Gokceada artisanal goat cheese. Small Ruminant Research. 2013;113(1):187-194. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2013.01.001.
12. Mohamed AG. Low-Fat Cheese: A Modern Demand. International Journal of Dairy Science. 2015;10(6):249-265. DOI: https://doi.org/10.3923/ijds.2015.249.265.
13. Soodam K, On L, Powell IB, Kentish SE, Gras SL. Effect of elevated temperature on the microstructure of full fat Cheddar cheese during ripening. Food Structure. 2017;14:8-16. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foostr.2017.05.003.
14. Caro I, Soto S, Fuentes L, Gutiérrez-Méndez N, García-Islas B, Monroy-Gayosso KE, et al. Compositional, Functional and Sensory Characteristics of Selected Mexican Cheeses. Food and Nutrition Sciences. 2014;5(4):366-375. DOI: https://doi.org/10.4236/fns.2014.54044.
15. Guarrasi V, Sannino C, Moschetti M, Bonanno A, Di Grigoli A, Settanni L. The individual contribution of starter and non-starter lactic acid bacteria to the volatile organic compound composition of Caciocavallo Palermitano cheese. International Journal of Food Microbiology. 2017;259:35-42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2017.07.022.
16. Kim NS, Lee JH, Han KM, Kim JW, Cho S, Kim J. Discrimination of commercial cheeses from fatty acid profiles and phytosterol contents obtained by GC and PCA. Food Chemistry. 2014;143:40-47. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.07.083.
17. Sádecká J, Kolek E, Pangallo D, Valík L, Kuchta T. Principal volatile odorants and dynamics of their formation during the production of May Bryndza cheese. Food Chemistry. 2014;150:301-306. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.10.163.
18. Caroprese M, Sevi A, Marino R, Santillo A, Tateo A, Albenzio M. Composition and textural properties of Mozzarella cheese naturally-enriched in polyunsaturated fatty acids. Journal of Dairy Research. 2013;80(3):276-282. DOI: https://doi.org/10.1017/S002202991300023X.
19. Prosekov AYu, Ivanova SA. Providing food security in the existing tendencies of population growth and political and economic instability in the world. Foods and Raw Materials. 2016;4(2):201-211. DOI: http://doi.org/10.21179/2308-4057-2016-2-201-211.
20. Abd El-Gawad IA, Hamed EM, Zidan MA, Shain AA. Fatty Acid Composition and Quality Characteristic of Some Vegetable Oils Used in Making Commercial Imitation Cheese in Egypt. Journal of Nutrition and Food Sciences. 2015;5(4):380-384. DOI: https://doi.org/10.4172/2155-9600.1000380.
21. Pietrzak-Fiećko R, Staniewska K, Staniewski B. Fatty acid profile of milk fat in the local dairy products from northeastern Poland. Polish Journal of Natural Sciences. 2017;32(1):143-151.
